Conţinut
În electroforeza cu gel, probele de ADN sau proteine sunt separate - de obicei în funcție de dimensiuni - prin aplicarea unui câmp electric care le determină să migreze printr-un gel. Utilizarea electroforezei cu gel este de rutină în laboratoarele de cercetare biomedicală și este utilizată pentru a răspunde la o varietate de întrebări diferite, astfel încât nu există într-adevăr un mod universal de a analiza rezultatele.
Diferite tehnici precum Western blotting, Northern Blotting și Southern Blotting, de exemplu, toate implică electroforeza cu gel.
Dacă efectuați electroforeza cu gel de agaroză a probelor de ADN, cel mai obișnuit tip de procedură, va trebui să faceți de obicei cel puțin două lucruri: 1) distinge plasmidele netăiate de inserții, plasmide obținute și plasmide tăiate și, 2) estimează mărimea diferitelor Fragmente de ADN cu o curbă standard Excel sau un calculator.
Iată cum funcționează.
Verificați notebook-ul de laborator pentru a determina ce probe au fost încărcate pe benzile. Când ați încărcat godeurile pentru gelul dvs., ar fi trebuit să observați identitatea fiecărei benzi / probe.
Determinați ce bandă conține „scara” standardelor ADN. Acestea sunt fragmente de lungime cunoscută; distanța lor de migrare poate fi utilizată pentru a determina dimensiunea fragmentelor de probă folosind o curbă standard Excel sau un alt calculator.
Folosind o riglă, măsurați distanța de pe poza dvs. de la puțuri până la colorantul de urmărire, care va fi parcurs mai departe decât oricare dintre benzile ADN (cu alte cuvinte, va fi în partea de jos a gelului). Înregistrați acest număr - unitățile pe care le utilizați nu sunt importante.
Măsurați distanța din poza dvs. de la fântâni până la fiecare dintre benzile din „scară”, apoi împărțiți această distanță în funcție de distanța parcursă de banda de colorant de urmărire. Acest calcul vă oferă mobilitatea relativă a fiecărei benzi.
Exemplu: Să presupunem că banda de urmărire a parcurs 6 centimetri și avem trei benzi care au parcurs 5, 4,5 și 3,5 inci.
Care este mobilitatea lor relativă? Răspuns: Împărțim 5, 4,5 și 3,5 cu 6 pentru a obține mobilități relative de 0,833, 0,75 și 0,5833.
Introduceți mobilitățile relative în programul foilor de calcul (Excel sau orice alt program similar pe care îl utilizați) împreună cu dimensiunea în kilobaze a fiecărui fragment din scară.
Producătorul vă oferă dimensiunea fiecărui fragment din scările pe care le furnizează, așa că ar trebui să aveți deja aceste informații.
Grafică datele cu mobilitate relativă pe x și dimensiunea în kilobaze pe y.
Utilizați funcția Trendline din programul dvs. de foi de calcul pentru a se potrivi cu o ecuație cu datele. Această ecuație ar trebui să fie o ecuație de putere (de exemplu, x ^ -2) și ar trebui să se potrivească relativ relativ bine (coeficientul R de cel puțin 0,9). Se creează o curbă și o curbă standard Excel.
Uită-te la benzile corespunzătoare eșantioanelor tale.
Amintiți-vă că fragmentele de ADN mai mici se deplasează mai departe prin gel decât fragmentele mari de ADN, deci cele mai apropiate de colorantul de urmărire vor fi cele mai mici. Rețineți, însă, că, dacă ADN-ul plasmidic (circular) nu este tăiat, acesta va deveni „suprapus” sau răsucit ca un cordon telefonic, ceea ce îl va determina să călătorească mai departe decât ADN liniar de aceeași dimensiune.
De asemenea, o plasmidă „rău” care a fost tăiată incomplet va călători a mai scurt distanță decât ADN liniar de aceeași dimensiune. În consecință, nu puteți estima dimensiunea plasmidelor necuprinse din gelul dumneavoastră.
Potriviți benzile din fiecare bandă cu identitatea eșantionului pe care l-ați încărcat pe acea bandă și determinați dacă ceea ce vedeți este ceea ce v-ați fi așteptat. Aceasta va depinde de natura experimentului dvs.
În general, însă, dacă ați digerat o plasmidă cu două enzime de restricție, așteptați ca inserția să fie eliberată de plasmidă.
Deoarece este mult mai mic decât plasmida, te-ai aștepta să vezi două benzi în acea bandă, una lângă vârf și cealaltă în apropiere de jos. O plasmidă tăiată cu o singură enzimă de restricție ar trebui să formeze o singură bandă care se deplasează puțin mai departe decât tăiatul de plasmidă cu două enzime de restricție, dar nicăieri aproape de inserție.
Măsurați distanța de la godeuri până la plasmida tăiată și introduceți benzi cu rigla. Împărțiți aceste numere la distanța parcursă de colorantul de urmărire pentru a găsi mobilitatea relativă a inserțiilor și plasmidelor tăiate.
Conectați mobilitatea relativă a inserțiilor și tăiați plasmidele în ecuația programului dvs. de foi de calcul calculat pentru dvs. Acest calcul ar trebui să vă ofere o estimare a mărimii acestor plasmide.