Conţinut
- Ce este electroforeza cu gel?
- Componente ale electroforezei
- Formarea gelului
- Cum funcționează electroforeza?
- Încărcarea și dimensiunea Determinați benzile ADN
- Aplicații și utilizări ale electroforezei
Electroforeza în gel, adesea numită și electroforeză ADN sau pur și simplu electroforeză, este o tehnică care este folosită pentru a separa fragmente de ADN (și alte molecule încărcate) în funcție de dimensiune. Acest lucru se face de obicei folosind gel de agaroză și sarcină electrică pentru a separa fragmente unul de celălalt.
Această tehnică are câteva aplicații, inclusiv examinarea ADN-ului, degetul ADN, criminologie și diverse aplicații medicale.
Ce este electroforeza cu gel?
Electroforeza cu gel este o tehnică care permite oamenilor de știință să separe moleculele încărcate în funcție de dimensiune. Aceasta include ADN, ARN și proteine.
Nu uitați, ADN-ul și ARN au o ușoară încărcare negativă datorită moleculelor de oxigen încărcate negativ în coloana vertebrală a zahăr-fosfat a moleculei. Proteinele pot avea o serie de sarcini în funcție de aminoacizii din lanțul polipeptidic.
Componente ale electroforezei
Pentru a efectua electroforeza, trebuie făcut mai întâi gelul. Acest lucru se poate face în aproape orice laborator; gelurile de agaroză sunt cele mai frecvente. Pentru a face gelul, pulberea de agaroză este amestecată cu un tampon special numit tampon de electroforeză. Acest amestec este apoi încălzit până la dizolvarea agarozei și amestecat complet în soluția tampon.
Rețineți că unele protocoale de electroforeză necesită adăugarea de bromură de etidiu (Et-Br). Aceasta colorează orice ADN utilizat în electroforeză pentru a vă permite să vizualizați poziția fragmentelor sub lumina UV.
Formarea gelului
Aceasta este turnată apoi într-o matriță dreptunghiulară numită tavă de turnare cu gel. Alături de mucegaiul care creează gelul dreptunghiular folosit pentru electroforeză, un pieptene este plasat la unul dintre capetele gelului. Acest pieptene face ca sondele în care sunt încărcate probele pe care doriți să le separați prin electroforeză. Puteți vedea o poză aici.
Odată ce gelul s-a întărit, pieptenele este îndepărtat și gelul este plasat într-un rezervor special de electroforeză. Un alt tampon este umplut în rezervor până când un ușor strat de tampon acoperă complet gelul de agaroză.
Acest rezervor produce un curent electric (cuprins între 50 și 150 V) prin soluția tampon și, la rândul său, prin gelul de agaroză. Sondele gelului de agaroză sunt plasate la capătul negativ al curentului ( catod) cu celălalt capăt al gelului la capătul pozitiv al curentului ( anod).
Cum funcționează electroforeza?
Înainte de a trece curentul electric prin rezervor și gel, probele dvs. sunt încărcate în puțuri. Aceasta se face folosind o micropipetă. Un eșantion de „marker”, cunoscut și sub denumirea de scară ADN, este un eșantion cu mărimi cunoscute ale fragmentului de ADN, care vă poate ajuta să comparați eșantioanele și să înțelegeți dimensiunile probei pe care le testați.
Deseori a urmărirea colorantului (numit și colorant de încărcare) se adaugă la fiecare probă pentru a vă ajuta să încărcați eșantionul în puțuri. Colorantul vă ajută, de asemenea, să urmăriți mișcarea probelor prin gel.
Deci, cum se deplasează probele efectiv prin gel și se separă după dimensiune? Are legătură cu curent electric care trece prin gelul de agaroză împreună cu mărimea / structura fragmentelor și gel de agaroză.
Încărcarea și dimensiunea Determinați benzile ADN
Amintiți-vă că, în general, taxa ADN este negativ . Deci, atunci când aceste probe sunt plasate în puțuri care sunt aproape de capătul negativ al curentului electric, acest lucru va determina ADN-ul încărcat negativ să se miște departe de catod (încărcare negativă) și mișcare spre anod (încărcare pozitivă) la capătul opus.
Pe lângă această mișcare a eșantioanelor, electroforeza separă, de asemenea, mărimile și fragmentele din aceste probe. Asta pentru ca molecule mai mici iar fragmentele pot mișcă-te mai repede și mai ușor prin gel în timp ce molecule mai mari și fragmente mișcați mai încet. Acest lucru înseamnă că fragmente mici se vor deplasa la capătul gelului mai repede decât cele mai mari și, ca urmare, separă fiecare fragment după dimensiune.
După ce gelul se rulează aproximativ o oră (în majoritatea protocoalelor), încărcarea este oprită și gelul este analizat. Veți vedea o bandă dreptunghiulară distinctă, numită adesea banda ADN sau banda proteică, în diferite puncte de-a lungul gelului. Fiecare bandă reprezintă un fragment care s-a mutat de-a lungul gelului.
Aplicații și utilizări ale electroforezei
Există multe aplicații pentru electroforeză în laborator. Iată doar câteva: