Conţinut
Atunci când lucrați cu cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC), o calibrare bună este absolut esențială pentru a asigura rezultate de calitate fiabile. Calibrarea corectă a unui instrument HPLC începe prin crearea unui standard de calibrare adecvat. În majoritatea cazurilor, calibrarea necesită, de fapt, o serie de standarde de concentrare crescândă pentru a produce ceea ce este cunoscut sub numele de curbă de calibrare. Aceasta este o linie grafică și ecuația asociată care descrie relația dintre concentrația substanței chimice testate și răspunsul detectorului HPLC.
Determinați substanța chimică pe care doriți să o testați pentru utilizarea HPLC („analitul”). De exemplu, s-ar putea să doriți să testați o serie de băuturi răcoritoare pentru conținutul de fructoză, caz în care fructoza ar fi analitul.
Obțineți o cantitate de substanță chimică din analit de puritate adecvată. În mod normal, puritatea ar trebui să depășească 99%, iar analitul trebuie să fie achiziționat de la o companie de aprovizionare chimică de renume. În cazul fructozei, de exemplu, ați cumpăra fructoză pură de la un furnizor de produse chimice și nu de la un magazin alimentar.
Determinați concentrațiile maxime și minime anticipate ale analitului în eșantioanele pe care intenționați să le testați pe HPLC. În cazul băuturilor răcoritoare, ați examina etichetele băuturilor și a determina cel mai mic și cel mai mare conținut de fructoză dintre băuturile pe care le veți testa. Rețineți că eșantionul inițial (băutura răcoritoare) poate fi diluat sau manipulat altfel în timpul pregătirii pentru analiză (în funcție de metoda HPLC utilizată) și astfel concentrația de analit din eșantioanele injectate efectiv pe HPLC poate fi modificată. Concentrația analitelor din eșantioane rulată pe HPLC trebuie luată în considerare.
Determinați solventul în care vă veți dizolva analitul pentru a face standardele de calibrare. Acest solvent trebuie să poată dizolva corect analitul pe o gamă relativ mare de concentrații (cel puțin la fel de mare ca în eșantioanele pe care intenționați să le testați). De asemenea, acest solvent ar trebui, în mod ideal, să fie destul de similar cu „faza mobilă”, solventul utilizat pentru a transporta probe prin instrumentul HPLC.
Calculați cantitatea de analit necesară pentru a realiza o soluție „standard de stoc” a analitului. Aceasta se constată prin înmulțirea concentrației necesare a standardului de stoc cu volumul dorit. Concentrația analitului din această soluție ar trebui să fie cu cel puțin 10% mai mare decât cea mai mare concentrație de eșantion anticipată. Dacă cea mai mare concentrație anticipată de fructoză dintr-un eșantion de băuturi răcoritoare este de 8 grame / 100 mililitri, atunci standardul de stoc ar putea fi obținut la o concentrație de 10 grame fructoză / 100 mililitri. Un volum rezonabil este de 500 de mililitri, astfel încât 8/100 ml x 500 ml = 40 grame fructoză ar fi necesară.
Se cântărește cantitatea necesară de analit la un nivel adecvat de precizie. Adesea, o valoare în greutate în grame precise pentru una sau două zecimale este potrivită, dar poate fi necesară o mai mare precizie pentru unele metode.
Transferați analitul cântărit într-un balon volumetric cu volumul necesar și adăugați solventul dorit pe marcajul de umplere din balon. Utilizarea unui balon volumetric (mai degrabă decât un pahar gradat, de exemplu) crește precizia valorii concentrației standard a stocului. Asigurați-vă că întregul analit este transferat în balon; folosiți o parte din solvent pentru a-l spăla, dacă este necesar.
Se oprește balonul volumetric și se agită ușor sau se inversează până se dizolvă complet analitul.
Efectuați o serie de diluții variate ale standardului de stoc, transferand volumele cunoscute ale standardului de stoc în baloane volumetrice, folosind pipete pentru transfer precis, apoi adăugând solvent. Cea mai mică concentrație standard ar trebui să fie sub cel mai scăzut eșantion anticipat de analizat. În exemplul de băuturi răcoritoare, dacă cea mai scăzută concentrație de fructoză așteptată într-un eșantion este de 2 grame / 100 ml, atunci s-ar putea face un standard de 1 gram / 100 ml. Aceasta se va face printr-o diluție de zece ori a standardului de stoc. Seria standard ar trebui să includă în total 5 sau 6 concentrații, astfel încât să fie necesare diluții suplimentare pentru a produce standarde de 3, 5 și 8 grame fructoză / ml. Acum aveți o serie de soluții standard cu care să calibrați HPLC.