Conţinut
Albastrul genetic al unei celule este codat în materialul său genetic sau ADN-ul. Deoarece ADN-ul nu părăsește niciodată nucleul celulei, pentru ca aceste informații să ajungă în citoplasmă unde rezidă alte proteine și componente biochimice, este necesar să transcriem ADN-ul în ARN mesager (ARNm sau ARN poli (A)). Acest mARN se transformă apoi în proteine care îndeplinesc multe funcții ale celulei. Pentru a detecta sau a cuantifica mRNA-urile foarte rare, creează sonde pentru microarrays sau construiește biblioteci de molecule de ADN complementare, mRNA trebuie izolat. Cu toate acestea, extracția ARN totală (adică tot ARN-ul dintr-o celulă) și izolarea ARNm ulterioară nu sunt procese reciproce excluse; prima trebuie efectuată pentru a putea fi extras ARNm.
Izolarea mRNA din ARN total
Omogenizarea TRIzol: ARN-ul total include toate ARNm-urile, ARN-ul de transfer, ARN-ul ribozomal și alte ARN-uri care nu codează. Pentru a le separa de celelalte componente celulare, celula este mai întâi deschisă pentru a-și elibera conținutul. Acest lucru se realizează prin resuspendarea celulelor peletate prin centrifugare (rotire la viteze mari) în reactiv TRIzol (Life Technologies). Alte versiuni de TRIzol (cum ar fi Reactivul TRI al Ambion) funcționează în mod similar.
Izolarea ARN totală: O serie de centrifugări este utilizată pentru a separa diferitele componente (proteine, ADN, ARN) ale celulei în straturi sau faze, în cadrul suspensiei. Faza de sus, de culoare galbenă, este compusă din grăsime și poate fi aruncată. Faza dorită este nuanțată, conține ARN total și este păstrată. După efectuarea unei extracții cu fenol-cloroform și o serie de spălări de alcool folosind izopropanol și etanol, ARN-ul poate fi granulat pentru izolarea ARNm. Adăugați inhibitori de RNază pentru a preveni degradarea ARN-ului total al acestei enzime.
Extracția ARNm: Este comună utilizarea unui kit pentru izolarea ARNm-urilor, deoarece protocoalele de laborator de casă nu generează cantități mari de ARNm-uri extrem de purificate. Trusele comerciale includ FastTrack 2.0 de la Invitrogen sau kitul de izolare mRNA pur al Ambion's Poly (A). Acești pași de bază sunt comuni pentru astfel de truse:
a) Se amestecă tamponul de liză inhibat de RNază furnizat în trusă cu până la 300 de microlitri de ARN total.
b) Se încălzește 5 minute la 65 de grade Celsius și apoi se răcește imediat proba pe gheață timp de un minut.
c) Amestecați acest lucru cu clorură de sodiu 0,5 M și apoi dizolvați complet Oligo dT (acid oligodeoxi-limimidilic) în acest eșantion.
d) Centrifugați acest eșantion și recuperați supernatantul, care este spălat de mai multe ori într-o serie de tampoane de legare și sare scăzută furnizate în kituri.
e) Eluați mRNA de mai multe ori până când se obține un volum specificat kit (de exemplu 500 microlitri).
f) Precipitați eluatul prin precipitare cu acetat de sodiu și etanol. Re-suspendați până la 20 de microlitri de apă tratată cu dietilpirocarbonat (DEPC).
g) Depozitați la -80 grade Celsius și verificați calitatea și cantitatea prin spectrofotometrie.