Conţinut
Reacția în lanț a polimerazei, sau PCR, este o tehnică care fotocopiează un fragment de ADN în multe fragmente - exponențial multe. Primul pas în PCR este încălzirea ADN-ului, astfel încât acesta să se denatureze sau să se topească în catenele unice. Structura ADN-ului este ca o scară de sfoară în care treptele sunt funii cu capete magnetice. Magneții se conectează pentru a forma treptele, numite perechi de baze și astfel rezistă să fie trase. Fiecare fragment de ADN se topește în catenele unice la temperaturi diferite. Înțelegerea modului în care structura ADN-ului este ținută împreună de părțile individuale ale ADN-ului vă va da seama de ce se topesc diferite fragmente de ADN la temperaturi diferite și de ce sunt necesare în primul rând astfel de temperaturi ridicate.
Topire! Topire!
Primul pas al PCR este acela de a topi ADN-ul, astfel încât ADN-ul dublu-catenar să se separe în ADN monocatenar. Pentru ADN-ul de mamifere, acest prim pas implică de obicei căldură de aproximativ 95 de grade Celcius (aproximativ 200 Fahrenheit). La această temperatură, legăturile de hidrogen între perechile de bază A-T și G-C, sau treptele din scara ADN, se desprind, decupând ADN-ul cu două cateni. Totuși, temperatura nu este suficient de fierbinte pentru a rupe coloana vertebrală a fosfatului-zahăr care formează firele unice sau poli ai scării. Separarea completă a catenelor unice le pregătește pentru a doua etapă a PCR, care este de răcire pentru a permite fragmente scurte de ADN, numite grunduri, pentru a lega catenele unice.
Fermoare magnetice
Unul dintre motivele pentru care ADN-ul este încălzit la temperatura ridicată de 95 de grade Celcius este că, cu cât ADN-ul este dublu mai lung, cu atât mai mult vrea să rămână împreună. Lungimea ADN-ului este un factor care afectează punctul de topire ales pentru PCR pe acea bucată de ADN. Perechile de bază A-T și G-C în legătura ADN cu catenă dublă între ele pentru a menține structura cu două fire. Cu cât mai multe perechi de baze consecutive între două catenele unice s-au legat, cu atât vecinii lor vor să se lege și cu atât atracția dintre cele două fire este mai puternică. Este ca un fermoar format din magneți mici. Pe măsură ce închideți fermoarul, magneții vor dori în mod natural să se închidă și să rămână cu fermoar.
Magneții mai puternici se lipesc mai bine
Un alt factor care afectează temperatura de topire pentru a alege fragmentul de ADN de interes este cantitatea de perechi de baze G-C prezente în acel fragment. Fiecare pereche de baze este ca doi mini-magneți care atrag. O pereche formată din G și C este mult mai puternic atrasă decât o pereche A și T. Astfel, o bucată de ADN care are mai multe perechi de G-C decât un alt fragment va necesita o temperatură mai mare înainte de a se topi în catene unice. ADN-ul absoarbe în mod natural lumina ultravioletă - la lungimea de undă de 260 de nanometri, pentru a fi exactă, iar ADN-ul monocatenar absoarbe mai multă lumină decât ADN-ul dublu-catenar. Așadar, măsurarea cantității de lumină absorbită este o modalitate de a măsura cât de mult s-a topit ADN-ul tău dublu în catenele unice. Efectul „fermoarului magnetic” al perechilor de bază G-C și A-T este ceea ce determină un grafic al absorbției de lumină a ADN-ului cu două catenuri, reprezentat de o creștere a temperaturii care să fie sigmoidă, în formă de S, și nu de linie dreaptă. Curba S reprezintă rezistența la munca în echipă pe care o exercită perechile de bază împotriva căldurii, deoarece nu vor să se separe.
Punctul pe jumătate
Temperatura la care o lungime de ADN se topește în catenele unice se numește temperatura de topire, care este notată prin abrevierea „Tm”. Aceasta indică temperatura la care jumătatea ADN-ului dintr-o soluție s-a topit în catene unice și cealaltă jumătate este încă în formă dublă. Temperatura de topire este diferită pentru fiecare fragment de ADN. ADN-ul mamifer are un conținut de G-C de 40%, ceea ce înseamnă că restul de 60% din perechile de baze sunt As și Ts. Conținutul său de 40% G-C face ca ADN-ul mamiferului să se topească la 87 de grade Celcius (aproximativ 189 Fahrenheit). Acesta este motivul pentru care primul pas al PCR pe ADN-ul mamiferului este încălzirea acestuia la 94 de grade Celcius (201 Fahrenheit). Doar cu șapte grade mai fierbinte decât temperatura de topire și toate firele duble se vor topi complet pe catenele unice.