Conţinut
Western blotting este una dintre cele mai frecvente proceduri în laboratoarele biochimice. Practic, separă proteinele de la un eșantion după mărime, apoi testează folosind anticorpi pentru a determina dacă există o proteină dată. Este util nu numai în cercetare, ci și în laboratoare medicale sau de diagnostic; testele atât pentru HIV, cât și pentru boala Lyme, de exemplu, implică un test imunosorbent legat de enzimă (ELISA), urmat de un Western blot dacă ELISA se dovedește pozitiv. În ciuda popularității sale, totuși, Western Blotting are mai multe dezavantaje.
Nonquantitative
Bloturile occidentale clasice nu sunt cantitative. Cu alte cuvinte, deși pot spune cercetătorilor dacă există o anumită proteină, acestea nu fac posibilă cuantificarea cât de mult din proteină este prezentă. Unele companii biotehnologice vând acum kituri care permit cercetătorilor sau tehnicienilor de laborator să cuantifice cantitatea de proteine prezente folosind o curbă standard - dar acest lucru funcționează numai dacă sunt disponibile probe pure de aceeași proteină. Mai mult decât atât, greutatea moleculară a unei proteine poate fi estimată numai cu Western Blotting, mai degrabă decât determinată exact ca în cazul spectrometriei de masă.
anticorpii
O Western blot poate fi efectuată numai dacă sunt disponibili anticorpi primari împotriva proteinei de interes. În timp ce anticorpii pentru multe proteine diferite sunt disponibile de la companiile biotehnologice, acestea nu sunt ieftine; dacă anticorpii primari nu sunt disponibili pentru o anumită proteină, nu va fi posibil să se efectueze Western blot în căutarea acelei proteine. Mai mult, cercetătorii ar putea dori să stabilească dacă o proteină a fost modificată într-un fel - dacă a fost fosforilată (avea un grup fosfat atașat la ea), de exemplu - și cu tehnica Western blot au nevoie de anticorpi specifici modificatului proteină.
Instruire
Poate fi dificil să efectuezi un Western Western în mod corespunzător și să obții rezultate bune, deci personalul trebuie să fie bine instruit.La fel ca în multe altele, experiența este poate cel mai bun îndrumător; chiar și pentru un tehnician experimentat, totuși, un Western Western necesită mult timp. Porțiunea de electroforeză pe gel a experimentului, de exemplu, va dura de obicei de la una la două ore până la rulare. Alte sarcini pot fi efectuate în timp ce gelul rulează, desigur, dar experimentul mai durează destul de mult timp pentru a obține rezultate.
Alte limitări
Anticorpii pot prezenta uneori o legare off-target, ceea ce poate duce la rezultate mai slabe. Mai mult decât atât, cu Western Blotting, utilizați un anticorp împotriva unei proteine specifice, astfel încât rezultatele dvs. vă vor spune doar dacă acea proteină a fost prezentă. Spectrometria de masă de înaltă rezoluție, prin contrast, dezvăluie toate proteinele prezente într-un eșantion și, spre deosebire de clasificarea occidentală clasică, este cantitativă. Este important să ne amintim, desigur, că spectrometria de masă este mult mai scumpă și, de asemenea, mai dificilă din punct de vedere tehnic de utilizat în comparație cu Western blotting.