Conţinut
- Electroforeza are o analiză limitată a eșantionului
- Măsurătorile electroforezei nu sunt precise
- Eșantionul de pornire substanțial este obligatoriu
- Doar anumite molecule pot fi vizualizate
- Electroforeza este cu debit redus
Electroforeza cu gel este o tehnică în care moleculele biologice sunt separate una de cealaltă și identificate în cercetarea biologică sau în diagnosticul medical. De la dezvoltarea lor în anii '70, aceste tehnici au fost de neprețuit în identificarea genelor (ADN) și a produselor genice (ARN și proteine) de interes pentru cercetare. În ultimii ani, au apărut tehnici mai noi care conferă o mai mare specificitate și detalii despre ceea ce se întâmplă în sistemele vii. Deși acestea nu au înlocuit tehnicile de electroforeză, iar manipulările avansate pot extinde viabilitatea tehnicii, este important să ne dăm seama ce poate și nu poate face electroforeza cu gel.
Electroforeza are o analiză limitată a eșantionului
Electroforeza este specifică oricărui țesut eșantionat. De exemplu, dacă folosiți un sudor (un tip de electroforeză) pe un tampon de obraz, vă uitați la gene din celulele epiteliale ale obrazului și nicăieri în corpul vostru. Uneori, acest lucru poate fi benefic, dar cercetătorii sunt deseori interesați de efecte mai răspândite.
Tehnicile precum hibridizarea in situ (ISH) pot prelua o secțiune de țesut și pot analiza expresia genelor la fiecare zonă mică din eșantion.Astfel, cercetătorii pot privi fiecare zonă a creierului dintr-un eșantion cu ISH, în timp ce tehnicile de electroforeză pot privi doar câteva zone simultan.
Măsurătorile electroforezei nu sunt precise
Electroforeza cu gel poate separa eficient proteine similare cu greutăți diferite (aceasta este o tehnică numită Western blotting). Le poate separa mai precis printr-o tehnică cunoscută sub numele de 2d electroforeză; acest lucru este frecvent în proteomică.
Din păcate, toate măsurătorile făcute din această tehnică sunt în cel mai bun caz semicantitative. Pentru a obține masa (greutatea) precisă a proteinelor, spectroscopia de masă trebuie utilizată după ce proteina a fost purificată prin electroforeză. Mai mult, compararea cantităților relative de molecule diferite se bazează pe densitatea benzii (întuneric) a diferitelor pete pe gel. Această metodă are un anumit grad de eroare, iar probele sunt de obicei rulate de mai multe ori pentru a obține rezultate curate.
Eșantionul de pornire substanțial este obligatoriu
Electroforeza este o tehnică de izolare și identificare vizuală a diferitelor biomolecule. Acest lucru se realizează prin trecerea unui curent electric prin gel pentru a separa molecule încărcate de diferite greutăți. Dacă molecula de care sunteți interesat nu este suficient de comună, banda ei va fi practic invizibilă și dificil de măsurat.
ADN-ul și ARN-ul pot fi amplificate oarecum înainte de a efectua electroforeza, dar nu este practic să se facă acest lucru cu proteine. Prin urmare, este necesară o probă mare de țesut pentru a efectua aceste teste. Acest lucru poate limita utilitatea tehnicii, în special în analiza medicală. Este practic imposibil să se efectueze electroforeză pe probe dintr-o singură celulă; citometria fluxului și imunohistochimia sunt mai frecvent utilizate pentru a evalua expresia celulă cu celule a proteinelor. O tehnică numită PCR este excelentă pentru măsurarea precisă a cantităților minime de ARN.
Doar anumite molecule pot fi vizualizate
Electroforeza este excelentă pentru separarea și identificarea biomoleculelor de dimensiuni medii și mari. Cu toate acestea, multe dintre moleculele pe care cercetătorii doresc să le privească sunt mai mici; hormoni mici, neurotransmițători și ioni nu pot fi măsurați prin electroforeză. Acest lucru este din două motive: nu reacționează în mod corespunzător cu prepararea electroforezei (de obicei o tehnică numită SDS PAGE) și, chiar dacă ar face acest lucru, sunt prea mici pentru a se separa corespunzător și ar grăbi partea de jos a gelului. Aceste molecule sunt măsurate în schimb prin tehnici precum RIAAs (imuno-analize radio) și ELISAs (test imunosorbant legat de enzimă).
Electroforeza este cu debit redus
Electroforeza cu gel este în general cu un randament redus, ceea ce înseamnă că nu produce date în special rapid. Electroforeză de contrast, unde puteți privi o mică mână de molecule de ARN simultan, cu PCR (reacția în lanț a polimerazei), care poate evalua simultan mii de probe. În mod similar, citometria în flux poate lua măsurători din mii de celule individuale și poate face corelații complexe, în timp ce electroforeza privește masele celulare și nu poate face astfel de discriminări fine. PCR și citometria fluxului reprezintă procese masive paralele și respectiv seriale și ambele depășesc cu mult abilitățile electroforezei de a genera date de cercetare.