Conţinut
Cantitați eșantionul de ARN măsurând absorbția acesteia de lumină ultravioletă (UV). Un spectrofotometru nano-drop va folosi doar unul sau două microlitre din proba dvs., pe care le puteți recupera. Alte spectrofotometre necesită o probă mult mai mare. Coeficientul de extincție pentru nucleotide la o lungime de undă UV de 260 nm pe o cale de lumină de 1 cm este 20. Pe baza acestui coeficient de extincție, absorbția de 40 pg / ml ARN este aceeași. Folosind aceste informații, puteți calcula concentrația probei de ARN.
Efectuați o diluare a eșantionului, dacă este necesar. O diluție standard pentru o microcuvetă este 1:40. Faceți această diluție adăugând 2 pL probă de ARN la 78 ui apă sterilă.
Urmați protocoalele spectrofotometrului dvs. special pentru a calibra mașina folosind un semifabricat și apoi determinați densitatea optică a probei dvs. la o lungime de undă UV de 260 nm.
Înmulțiți absorbanța eșantionului dvs. cu factorul de diluare cu 40 μg ARN / ml. Ecuația ar fi: „Concentrația ARN (µg / ml) = (OD260) x (factorul de diluare) x (40 pg ARN / ml) / (1 unitate OD260)” (Hofstra.edu) De exemplu: Dacă ați diluat proba dvs. cu 1:40, iar valoarea dvs. de absorbție a fost de 0,08, veți multiplica 0,08 x 40 x 40 = 128 µg / ml = 0,13 µg / μL
Figurați puritatea eșantionului dvs. luând o altă lectură de absorbție la 280nm lungime de undă UV. Raportul OD 260 / OD 280 va indica dacă - și la ce nivel - eșantionul dvs. este contaminat cu proteine sau fenol. Un rezultat de la 1,8 la 2,0 indică ARN de calitate.