Conţinut
DNA
Acid și proteine dezoxiribonucleice. ADN-ul este organizat în unități numite gene, fiecare dintre acestea codând pentru un anumit ARN sau o secvență de proteine. Genele sunt studiate pentru a afla despre structura și funcția biologică, evoluția, boala și multe alte aspecte ale sistemelor vii. Pentru a studia genele în detaliu, ADN-ul trebuie izolat și purificat de celulele de interes.
Extracție ADN
Deși ADN-ul dintr-o singură celulă poate fi extras și studiat, nu este suficient pentru a vedea cu ochiul liber. Pentru a obține o cantitate suficientă pentru spooling, cu atât mai multe celule trebuie să lucrezi cu mai bine (multe milioane).
Protocoalele exacte variază considerabil pentru a ține cont de caracteristicile unice ale eșantioanelor specifice, dar etapele generale sunt omogenizarea, liza, digestia, separarea și colectarea. Procedura se realizează cel mai bine într-un tub mic (în funcție de dimensiunea probei) de sticlă sau tub de plastic.
Un eșantion este în general amestecat sau împământat pentru a separa complet celulele una de alta. Acest lucru face ca ingredientele celulare să fie mai accesibile reactivilor care urmează. Detergentul sau enzimele sunt apoi adăugate la omogenat pentru a liza membranele celulare (și membranele nucleare dacă celulele sunt eucariote) pentru a elibera ADN-ul. În acest moment, ADN-ul este înconjurat de proteine, lipide, carbohidrați --- orice altceva a fost conținut în celule.
O digestie suplimentară enzimatică poate fi necesară pentru a descompune proteinele, astfel încât acestea să nu se lege de ADN și să interfereze cu colectarea acestuia. ADN-ul este separat de restul conținutului celular prin adăugarea de alcool rece, pur, etilic sau izopropilic. ADN-ul nu este solubil în acești alcooli, așa că se va condensa pentru a încerca să-și minimizeze contactul cu alcoolul. ADN-ul condensat este apoi colectat, de obicei prin centrifugare --- sau prin spooling.
Sporirea ADN-ului
Colectarea ADN-ului prin spooling este eficientă atunci când se obține o cantitate mare de ADN dintr-o procedură de extracție. Este, de asemenea, o metodă demonstrativă excelentă, deoarece o încurcătură impresionantă de ADN pur este clar vizibilă.
Pentru a derula ADN, etapa de separare trebuie efectuată cu atenție. Dacă nu a fost adăugată anterior într-o parte a amestecului de reactiv de liză, trebuie adăugată o soluție concentrată de sare (clorură de sodiu) înaintea etapei de adăugare a alcoolului. Alcoolul rece este turnat încet pe partea de eprubetă pentru a forma un strat deasupra soluției apoase, evitând amestecarea. Dacă este făcut corect, alcoolul își va forma propriul strat deasupra stratului sărat. Apoi vine spirtul.
Pentru a colecta ADN-ul din stratul sărat, așezați cu atenție o tijă de agitare de sticlă, deși stratul de alcool până atinge fundul tubului. Rotiți încet tija între degete, urmărind interfața dintre cele două straturi. Dacă este prezent suficient ADN, acesta se va grupa la interfața dintre straturi pentru a forma o masă translucidă lăptoasă. Învârtiți tija pentru a înfășura ADN-ul în jurul său (adică partea de bobinare) și trageți-o din tub. ADN-ul poate fi transferat într-un alt tub de alcool pur pentru depozitare sau analiză ulterioară.