Potrivit site-ului web al Universității Wisconsins BioWeb, un primer PCR este o oligonucleotidă sintetică scurtă (de obicei între 18 și 25 de baze) folosită pentru a amplifica regiunile specifice ale ADN-ului într-o tehnică de biologie moleculară cunoscută sub numele de reacție în lanț a polimerazei (PCR). Atât un primer înainte cât și unul invers sunt necesare, concepute pentru a fi complemente invers ale catenelor ADN, pentru a flanca și lega regiunea dorită de ADN. Atunci când oamenii de știință doresc să efectueze cercetări asupra unei gene sau regiuni specifice de ADN, ei trebuie mai întâi să efectueze PCR pentru a dobândi suficient din regiunea țintă cu care să lucreze. Proiectarea secvențelor de grund pentru regiunea de interes poate fi necesară dacă nu sunt deja disponibile prin cercetări publicate anterior sau prin mijloace comerciale.
Obțineți secvența de nucleotide a genei sau a regiunii ADN de interes și decideți cât timp doriți să amplificați un fragment. Grundul înainte și invers este proiectat să se lege la începutul și la sfârșitul fragmentului dorit. De obicei, metodele PCR convenționale utilizează primer care flanchează o regiune între 100 până la 1.000 de perechi de baze, în timp ce metodele PCR în timp real folosesc fragmente de aproximativ 50 până la 200 de perechi de bază.
Decideți locul în care doriți să se întindă primerii. De exemplu, s-ar putea să doriți locația lângă capătul 5 sau 3 al secvenței sau în mijloc. Dacă doriți, desemnați locația primerilor pentru a întinde un intron.
Urmați recomandările recomandate pentru proiectarea primerului. Amplificarea cu succes a produsului ADN depinde de calitatea primerilor și anumite variabile sunt critice.
Proiectați primerii cu o lungime de 18 până la 24 de baze. Vincent R. Prezioso, doctor, de la Brinkmann Instruments Inc., sugerează că această lungime este suficient de lungă pentru a fi extrem de specifică regiunii dorite de ADN, dar suficient de scurtă pentru a se lega (anneal) cu ușurință. Temperatura de topire primară (Tm) trebuie să fie cuprinsă între 55 și 80 de grade Celsius, suficient de scăzută pentru a permite topirea completă la sau peste 90 de grade Celsius, dar suficient de ridicată pentru a permite recoacerea. Conținutul de GC (procent de Gs și Cs în secvență) ar trebui să fie între 40 și 60 la sută. Capătul 3 al secvenței de grund trebuie să se termine într-un C sau un G (numit clemă GC) pentru a promova legarea, deoarece nucleotidele G și C au legături mai puternice, totuși, evitați să aveți trei sau mai multe Gs sau C în ultimele cinci baze. a secvenței.
Evitați să aveți patru sau mai multe baze (cum ar fi ACCCC ...) sau patru sau mai multe repetări di-nucleotide (cum ar fi ATATATAT ...), deoarece acestea pot provoca greșeli.Proiectați primerii fără omologie intra-primer (mai mult de trei baze care se completează în interiorul unui primer în sine) sau omologie inter-primer (unde primerul înainte și invers au secvențe complementare). Acest lucru poate provoca auto-dimer sau primer-dimer, unde primerii se leagă de ei înșiși, în loc să se lege la secvența de ADN dorită.
Utilizați resurse online și site-uri web care ajută la proiectarea primerului sau ajută la verificarea secvențelor de primer pentru auto-complementaritate sau potențialul de a realiza structuri secundare, cum ar fi tunsori. Unele site-uri web de proiectare de primare includ Institutul de Tehnologii din Massachusetts Primer3, Centrul Național pentru Informații Biotehnologice Primer-Blast și Integrated DNA Technologies OligoAnalyzer.